ПЦР анализ: что это такое? На какие 12 инфекций сдается?
Алексеева Мария Юрьевна
Мочалов Павел Александрович
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – наиболее информативный, точный и современный метод диагностики инфекционных заболеваний, позволяющий обнаружить возбудителя в организме пациента, даже если количество вредоносных клеток исчисляется единицами, и они пока не успели спровоцировать развитие болезни. Ещё 25 лет назад врачи не могли даже мечтать о таких возможностях, а сегодня сдать анализ ПЦР можно в любой крупной лаборатории.
ПЦР-диагностика открыла перед людьми многие другие ценные перспективы – с помощью этой методики можно изучать генные мутации, устанавливать отцовство, вычислять риск развития онкологических заболеваний, оценивать возраст и происхождение археологических артефактов и даже доказывать вину преступников, обнаруживая их ДНК в уликах. Но сегодня мы обсудим именно медицинский аспект этого открытия и расскажем вам, какие заболевания можно диагностировать методом ПЦР, как сдавать анализ и что означают его результаты.
Содержание:
ПЦР - что это такое?
Любое живое существо на Земле, будь то человек, животное или микроб, имеет гены – носители наследственной информации, которые представляют собой участки ДНК или РНК с определённой последовательностью нуклеотидов, уникальной для каждого организма. ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) и РНК (рибонуклеиновая кислота) образует длинные молекулы, состоящие из двух нитей, закрученных в спираль друг относительно друга, и эти нити собираются из нуклеотидов, как из бусинок.
Допустим, требуется увидеть, есть ли в биологическом материале пациента ДНК или РНК инфекционного возбудителя или её фрагменты. Но как это сделать, если молекулы крошечные и их мало? Методика ПЦР даёт ответ: можно искусственно размножить вредоносную ДНК или РНК в лабораторных условиях, чтобы без труда её обнаружить и идентифицировать.
Суть полимеразной цепной реакции состоит в том, чтобы разъединить нити молекул и попытаться «подсадить» к их противоположным концам фрагменты ДНК или РНК возбудителей – если они подойдут, значит, это и есть искомый микроб. А добавленный в пробирку фермент под названием «ДНК-полимераза» запустит синтез новых копий нужных участков молекул, они многократно размножатся и станут заметны. Далее мы опишем простыми словами, как происходит этот удивительный процесс и для чего это необходимо.
Американский учёный Кэрри Муллис изобрел ПЦР в 1983 году, а спустя десять лет, в 1993 году, получил за своё открытие Нобелевскую премию по химии. Однако методика была несовершенной и требовала существенных доработок. На сегодняшний день существует уже более десятка видов ПЦР для разных диагностических целей.
В случае с ПЦР-диагностикой в режиме реального времени (Real-Time PCR) влияние человеческого фактора на итоги исследования минимально – пробирки помещаются в современный высокотехнологичный прибор и ни разу не открываются на протяжении всех циклов, включая анализ результатов, который тоже проводит умная машина. У этого способа только два очевидных недостатка – высокая стоимость и ограниченная доступность, поскольку амплификаторами нового поколения оснащена далеко не каждая лаборатория.
[Видео] Наглядная информация - что такое ПЦР, и как происходит процесс?
Какие инфекции позволяет выявить мазок на ПЦР?
Вот лишь неполный список тех вредоносных микроорганизмов, которые можно обнаружить с помощью ПЦР-анализа:
Обширное семейство герпес-вирусов, в том числе цитомегаловирус, варицелла-зостер, вирус Эпштейна-Барра и другие;
ВИЧ;
Гепатиты;
Папилломовирусы;
Цитомегаловирус;
Парвовирусы;
Риновирусы;
Пикорнавирусы;
Рубивирусы;
Микобактерии туберкулёза;
Гемофильная палочка;
Холерный вибрион;
Бледная трепонема;
Стафилококки;
Менингококки;
Стрептококки;
Гонококки;
Легионеллы;
Шигеллы;
Сальмонеллы;
Бруцеллы;
Клостридии;
Листерии;
Боррелии;
Хеликобактерии;
Токсоплазмы;
Микоплазмы;
Уреаплазмы;
Хламидии;
Трихомонады;
Гарднереллы;
Кандиды.
Методика ПЦР нашла своё применение не только в клинической медицине, но и в криминалистике, археологии, экологии, ветеринарии, фармакологии, генной инженерии и производстве продуктов питания – везде, где может оказаться полезным анализ ДНК.
[Видео] Полимеразная цепная реакция:
Плюсы и минусы ПЦР
К неоспоримым преимуществам метода полимеразной цепной реакции относятся следующие аспекты:
Точность. Диагностические приёмы, на которые опиралась медицина до начала эпохи ПЦР, зачастую основывались на косвенном определении возбудителей болезни: в ходе анализа искались антитела к ним, признаки их присутствия, продукты их жизнедеятельности. ПЦР же узнает конкретный микроорганизм «в лицо», обнаруживает его ДНК или РНК, следовательно, появляется возможность выбрать максимально эффективную тактику лечения;
Надежность. По этому параметру ПЦР-диагностика далеко опережает конкурентов и приближается к 100%. Правильнее будет сказать так: если условия подготовки, забора, транспортировки, проведения анализа и оценки итогов были соблюдены неукоснительно, никакой ошибки быть не может. Ложноотрицательный результат возможен только в случае некорректно взятого материала, а ложноположительный – в случае попадания посторонних примесей в образец на любом из этапов исследования;
Чувствительность. Методика ПЦР уникальна ещё и тем, что позволяет обнаружить инфекционного агента в пробе, даже если там содержится всего одна молекула его ДНК. Это открывает широкие возможности по своевременной диагностике заболеваний или даже предотвращению их развития, если возбудитель ещё не размножился и не активизировался в организме человека. Кроме того, ПЦР-анализ может определить так называемую вирусную нагрузку – вычислить примерное количество копий вируса в крови и дать ответ, насколько тяжело течение болезни, вероятен ли её рецидив в случае ремиссии, существует ли риск её передачи другим людям;
Универсальность. Можно сдать ПЦР-анализ всего один раз и получить ответ, имеются ли у вас какие-либо инфекции из целого списка вероятных диагнозов. Особенно это актуально в случае с заболеваниями, передающимися половым путём – они нередко соседствуют друг с другом. Загрузив образец биоматериала пациента в амплификатор и добавив в пробирку праймеры сразу нескольких возбудителей, специалист сможет обнаружить присутствие каждого из них;
Скорость. Как мы уже рассказали выше, весь цикл ПЦР-диагностики занимает по времени не более 2-3 часов. Разумеется, нужно сделать поправку на загруженность лаборатории и процесс сбора биоматериала, но большинство современных диагностических центров предоставляют своим пациентам готовые результаты анализа ПЦР в день обращения или на следующие сутки.
Как ни странно, недостатки у полимеразной цепной реакции тоже есть:
Очень высокие требования к чистоте образца. Попадание в пробу посторонних примесей на любом из этапов диагностики грозит получением ложноположительного результата. А микробов вокруг человека миллионы, они содержатся практически везде;
Вероятность амплификации ДНК мертвых микроорганизмов. Бывает так, что человек уже переболел, а молекулы погибшего возбудителя всё ещё присутствуют в его организме, прибор определяет их и также даёт ложноположительный ответ;
Проблема неопознанных инфекций и мутаций. Теоретически может быть так, что в образце будут присутствовать такие микробы, для которых вообще ещё не разработаны праймеры, или они существуют, но по какой-то причине не были включены в реакцию. Кроме того, возбудители инфекций постоянно мутируют, приспосабливаясь к меняющимся условиям и новым лекарствам. Соответственно, уже имеющиеся праймеры теряют актуальность, потому что перестают соответствовать своему прототипу.
Виды ПЦР
К сегодняшнему дню на вооружении медицины появилось более десятка различных видов полимеразной цепной реакции: рекомбиназная, вложенная, инвертированная, ассиметричная, ступенчатая, групп-специфическая, с обратной транскрипцией, с «горячим стартом» и так далее – все они разработаны с учётом конкретных диагностических требований. Человеку несведущему в молекулярной биологии было бы сложно, да и скучно разбираться в тонкостях этой типологии. По настоящему интересны те виды ПЦР, которые широко используются на практике и активно предлагаются пациентам. Вот об этих анализах давайте и поговорим подробнее.
ПЦР 12
Рекордсменом по популярности заслуженно выступает так называемый комплексный анализ ПЦР 12 – он называется так потому, что включает в себя 12 наиболее распространённых половых инфекций, а также контрольный тест на качество взятых материалов (КВМ).
Почему этот вид диагностики так актуален? Во-первых, потому что он соответствует печальным реалиям нынешнего времени, когда у одного пациента кожно-венерологического профиля обнаруживается целый «букет» нехороших болячек. Во-вторых, потому что лабораториям проще пользоваться готовым картриджем, который содержит сразу все необходимые праймеры. В-третьих, это выгоднее для самого пациента, поскольку комплексный анализ обойдется дешевле, чем обследование на наличие каждой ИППП по отдельности.
Как сдают анализ ПЦР 12? У мужчин берут мазок из уретры. Это не очень приятная, но вполне терпимая и быстрая манипуляция. У женщин берут эпителиальный соскоб из влагалища или с шейки матки. Эта процедура, как правило, не вызывает болезненных ощущений. О правилах подготовки к визиту в лабораторию читайте ниже.
Стандартный набор ПЦР 12 выглядит следующим образом:
Вирусы герпеса 1 и 2 типа;
Папилломовирусы 16 и 18 типа (онкогенные);
Микоплазмы двух типов – человеческая и генитальная;
Цитомегаловирус;
Хламидия;
Трихомонада;
Гонококк;
Кандида.
Тринадцатым в этом списке выступает КВМ – контроль взятия мазка, который осуществляется путём поиска гена HMBS. Им обладают эпителиальные клетки, выстилающие уретру. Когда мазок берут из другого места, ищут другой ген. Если в образце будет обнаружено 250 и более копий нужного гена, значит, анализ ПЦР 12 взят корректно, и его итогам можно доверять. Если же копий специфического гена будет меньше нормы, лучше пройти повторную диагностику во избежание ложноотрицательного результата. Что касается положительных ответов, то они принимаются за истину в любом случае.
Список возбудителей, исследуемых в рамках анализа ПЦР 12, может отличаться в разных лабораториях. Например, туда могут быть включены дополнительные типы вируса герпеса или папилломовируса, тогда анализ будет называться «ПЦР 13» или «ПЦР 14». Иногда перечень, наоборот, сокращается до «ПЦР 4» (гонорея-трихомониаз-хламидиоз-микоплазмоз).
ПЦР качественная и ПЦР количественная
У этих двух видов ПЦР-диагностики принципиально разные цели: качественный анализ даёт ответ на вопрос, имеется ли вообще у пациента искомый микроб, то есть просто «да» или «нет». Только что рассмотренный комплекс ПЦР 12 относится как раз к этой категории.
Но существует ещё количественный анализ, или ПЦР в режиме реального времени. Метод основывается на том, что число новых ампликонов (копий заданного участка ДНК возбудителя болезни) прямо пропорционально их исходному количеству. То есть если в пробе с самого начала было много вредоносных молекул ДНК, то с каждым циклом полимеразной цепной реакции их будет становиться вдвое больше, а к концу процесса накопятся миллионы. Современные приборы амплификаторы следят за тем, как меняется количество копий, и по итогам исследования вычисляют примерную концентрацию возбудителя в организме пациента.
Для чего это нужно? В случае с бактериями, простейшими или грибками подобные сведения имеют спорную диагностическую ценность, поскольку численность колоний постоянно меняется под воздействием самых разных факторов, да и уничтожить такие микроорганизмы сравнительно просто. Другое дело – вирус. Это неклеточная форма жизни, которую невозможно истребить подобно тому, как антибиотики справляются с бактериями. В борьбе с вирусами человек может твёрдо рассчитывать только на свой иммунитет, а возможности противовирусных средств сильно ограничены. Именно когда дело касается вирусов, становится особенно актуальной методика ПЦР в режиме реального времени.
Вирусная нагрузка или виремия – это степень тяжести поражения организма вирусом. Показатель рассчитывается путём определения числа вирионов в биологическом материале, измеряется в МЕ или в количестве копий на 1 мл крови и служит для контроля над ходом терапии и предупреждения распространения вируса.
ПЦР количественная критически необходима носителям следующих инфекций:
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ);
Гепатит B и C.
Но и в случае с другими вирусами определение нагрузки может оказаться полезным – например, когда речь идёт о цитомегаловирусе, герпесе или папилломовирусе. Анализ поможет понять, грозит ли человеку очередное обострение болезни, и насколько высока вероятность передачи инфекции.
ВИЧ-инфицированным людям назначается антиретровирусная терапия. Её цель – максимально снизить вирусную нагрузку, а в идеале – сделать её неопределяемой. Но даже в этом случае существует риск заразить своего полового партнёра или партнёршу, поэтому не следует пренебрегать использованием презервативов.
[Видео] Вирусная нагрузка и её отслеживание для ВИЧ-инфицированных:
Что сдают на ПЦР-анализ?
При выборе типа биоматериала для диагностики врачи ориентируются на специфику инфекции, на её излюбленную локализацию. Ведь от того, попадет ли вредоносная ДНК в пробу, зависит то, будет ли получен достоверный результат анализа.
Для ПЦР берутся следующие материалы:
Мазок или эпителиальный соскоб со слизистых оболочек. Это может быть уретра, влагалище, шейка матки, цервикальный канал, задний проход, ротовая, носовая и даже глазная полость. Мазки наиболее актуальны при диагностике заболеваний, передающихся половым путём. Для взятия мазка или соскоба используются зонды с разными наконечниками;
Кровь из вены берут, когда нужно обнаружить ВИЧ, гепатит, цитомегаловирус, мононуклеоз или какое-либо заболевание бактериальной этиологии, например, сифилис, холеру или боррелиоз;
Биологические жидкости (моча, слюна, сперма, мокрота, секрет предстательной железы, желудочный сок, плевральная, суставная, спинномозговая или амниотическая жидкость, а также бронхоальвеолярный лаваж) берутся по показаниям. Например, ПЦР-анализ мокроты используется при диагностике туберкулёза;
Пунктаты и биоптаты органов и тканей, как правило, берутся при подозрении на онкологию. Исключение составляет биопсия желудка, которую проводят для определения наличия Helicobacter pylori – бактерии, вызывающей гастрит и язвенную болезнь.
Хранение и транспортировка биоматериалов
Пробы подлежат отправке в амплификатор не позднее, чем через 2 часа после забора, если они находятся в помещении при комнатной температуре. Когда ПЦР-анализ нужно по какой-то причине отложить, пробирки с биоматериалами допустимо оставить в холодильнике на одни сутки при температуре 2 – 8°С. Максимальный срок хранения – 14 дней, но тогда пробы подвергаются глубокой заморозке (-20°С). После оттаивания они должны быть сразу использованы, повторное замораживание запрещено.
В подавляющем большинстве случаев ПЦР-диагностика проводится «день в день»: пациент приходит в клинику, где у него берут мазок или кровь и сразу отправляют биоматериал в лабораторию, поэтому беспокоиться о правилах хранения не стоит.
Как подготовиться к ПЦР-диагностике?
Правила довольно просты:
Мазок или соскоб из половых путей, как у мужчин, так и у женщин, сдается после 72-часового воздержания от сексуальных контактов, непосредственно перед забором нужно произвести туалет интимной зоны и 2-3 часа не мочиться. Прекрасной половине человечества не следует планировать визит в лабораторию во время менструации и сразу после неё, кроме того, запрещено использовать какие-либо средства, нарушающие естественное состояние микрофлоры влагалища (спринцевания, свечи). Всем пациентам необходимо завершить антибактериальную терапию (если таковая проводилась) не позднее, чем за 2 недели до ПЦР-анализа;
Кровь сдается из вены утром натощак;
Мочу и сперму собирают в маленькие стерильные контейнеры, которые можно приобрести в аптеке, если процедура забора будет производиться дома. Но не забывайте о сроках хранения и транспортировки биоматериалов – максимум 2 часа;
Слюну собирают после 3 часов воздержания от приёма пищи и напитков, допустимо только полоскать рот водой. Непосредственно перед забором рекомендуется помассировать область слюнных желёз.
Прочие, редко используемые виды биоматериалов собирают только в клинике, где вам и предоставят все необходимые пояснения относительно подготовки.
Результаты ПЦР-анализа
Выше мы упоминали о качественной и количественной ПЦР-диагностике, так вот, в первом случае расшифровка результатов не представляет никакой трудности: ответ либо положительный, либо отрицательный. И если условия подготовки, сбора биоматериала, проведения анализа и оценки итогов не были нарушены, то нет и причин сомневаться в достоверности полученных данных.
По-другому дело обстоит в случае с ПЦР количественной. Её результатом является число, демонстрирующее вирусную нагрузку. Измеряется виремия в МЕ/мл или в копиях/мл, при этом в одной МЕ (международной единице) содержится примерно 4 копии вируса (точную цифру нужно узнавать в лаборатории, проводившей анализ, поскольку оборудование у всех разное).
Например, для гепатита C вирусная нагрузка до 600 000 МЕ/мл считается низкой, 800 000 МЕ/мл – средней, а 1 000 000 МЕ/мл – уже высокой.
В некоторых клиниках для большей компактности результатов количественного анализа ПЦР используют записи следующего вида: 3*103 МЕ/мл, 4*104 МЕ/мл, 5*105 МЕ/мл и так далее. Чтобы понять, о какой цифре идёт речь, достаточно произвести умножение.
Сколько стоит сдать ПЦР?
Цены сильно разнятся в зависимости от региона и типа клиники. Дешевле обследоваться в государственном медучреждении, комфортнее и быстрее – в частном диагностическом центре, все логично.
Стоимость качественного ПЦР-анализа на наличие основных ЗППП (хламидиоза, гонореи, микоплазмоза, уреаплазмоза, трихомониаза), герпеса, гепатита и папилломовируса разных типов, ВИЧ, цитомегаловируса, хеликобактерии и т. д. составляет в среднем от 250 до 600 рублей за каждого конкретного возбудителя.
Количественный анализ почти всегда стоит дороже, чем качественный, а в случае с ВИЧ и гепатитом – значительно дороже. Например, больные гепатитом москвичи могут узнать свою вирусную нагрузку за 3500-6000 рублей, ВИЧ-инфицированные – за 11000-13000 рублей.
Чтобы сэкономить на ПЦР-диагностике, заказывайте комплексные пакеты анализов, например, сразу на все самые распространённые ЗППП, системные или респираторные инфекции – так получится значительно дешевле, да и уверенности в своём здоровье будет больше. Средняя цена пакета или «скрининга» - 1500-2500 рублей.
Пользуйтесь услугами муниципальных лабораторий или частных медицинских центров с проверенной репутацией – мы не будем их здесь называть во избежание рекламы, но вы легко их найдете, как только вобьете в поисковую строку запрос вида «сдать ПЦР анализ». В заключение хотелось бы напомнить о ценности своевременной диагностики инфекций: если вы подозреваете, что заразились чем-то, или, тем более, уже плохо себя чувствуете, не надейтесь на «авось» и не прибегайте к самолечению – лучше как можно скорее отправляйтесь к врачу. Берегите себя, и будьте здоровы!
[Видео] Врач дерматовенеролог, уролог Ленкин Сергей Геннадьевич расскажет о всех нюансах ПЦР анализа:
